材料基因研究中的几个技术问题讨论

材料基因研究中的几个技术问题讨论
羽飞

摘要
RNA干扰现象，基因靶向技术，细胞核重新编程，GFP绿色荧光蛋白既是大学《细胞生物学》的基础内容，又是诺奖成果与世界研究热点。1991，2006 ，2007， 2012诺贝尔生理学奖都被写进中国各大学教材，当成真理在大学里教授学生。本文试讨论这些世界最先进科研成果用的技术如电镜分析，文献引用，数理方法，临床应用，实用性值得怀疑等方面的问题，读者可以从中得出的教训，让人少走弯路，少犯错误。


讨论

大学«生物学»课程多是高中«生物学»课程的简单扩展，有些甚至是争议问题的延伸，大学课程比中学课程系统性要差很多。课程没有标准，以诺奖成果为标准就成了自然而然的事情。

对于RNA干扰技术抑制基因表达，2006年诺贝尔医学奖奖励发现RNA干扰现象，帮助理解细胞战胜病毒感染的过程。RNA干扰（RNAi）是指一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的转译或转录来抑制基因表达。

生物体内所有细胞含有相同DNA信息，为什么会存在完全不同类型的细胞，这是由于生物体的宏观效应影响了细胞围观结构。生物体的宏观效应迫使细胞在特定时间关闭了生物体不需要的基因，这就是所谓的基因沉默效应。

与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播系统性RNA干扰。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，有时可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。毫无疑问RNAi现象在生物中是普遍存在的，本质上讲，RNAi与转录基因沉默在分子层次上是一码事。非常有意思是，2006年诺奖是用一副漫画，而不是更严肃的电镜照片来介绍RNA干扰现象，给人娱乐性而非学术性感觉。

本科生写实验报告时都忌讳漫画，本科生都知道实验过程尽量用实际细胞照片，少用画画。油画，卡通再形象也只是猜想，远不如照片有说服力。比如革兰氏阳性菌是单膜菌，阴性菌是双膜菌，青霉素破坏细胞壁，质粒，芽孢，真核细胞，用漫画科学性说服力不够，不如干细胞stem cell用照片一目了然。

先看RNA干扰现象的文献问题，RNA干扰现象没有任何可以重复实验证实的结果，至少查不到可靠的文献与专利，比如迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的好几干个与RNAi有关的蛋白因子，如果蝇（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在着称为Argonaute2（AGO2）的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。

应该说明的是，果蝇是实验室基因研究的变色龙，非常善变，任何荒谬的理论都可以有图有真相地在果蝇实验中得到证实。果蝇研究的最大问题是不合乎枚举学原理，取样不科学。生物物种千差万别，豌豆的研究最多只能证明豌豆的遗传现象，果蝇的研究成果最多只能说明果蝇的情况，不能自然延伸到其他物种。

现在果蝇的研究成果任何地方都在用，遗传学，发育基因调控，帕金森氏病，老年痴呆症，药物成瘾，失眠症，多梦症，酒精中毒，衰老长寿，免疫，胚胎，肺病，学习记忆等各种疑难杂症。果蝇的研究成果与中医一样，课堂上讲起来头头是道，用起来不灵。33年，46年， 95年， 04 年，11年， 17年诺奖都授予果蝇研究。人类对生命的认识完全是从吃腐烂水果的果蝇的研究中类推得来的。

RNA干扰是抑制破坏基因结构的一种DNA片段转录子活性的重要方式。在逆转录过程中产生的双链RNA分子可以被Dicer识别，从而被降解。这个结论完全是空穴来风，没有实验证实，有几篇博士论文的实验一直饱受可重复性质疑。

有学者曾指出RNA干扰的作用引用的文献来源不可靠，2001年，Tuschl将siRNA导入到哺乳动物细胞中并声称发现在哺乳细胞内导入长的双链RNA时引发的干扰素效应，由此在没有任何人体实验文献的情况下，拓展了RNAi在基因治疗上应用前景。RNAi机制普遍存在于动植物，尤其是低等生物中。但不能得出结论RNAi是进化上相对保守的基因表达调控机制，生命现象错综复杂，千差万别，进化绝对不是单一因子就可以决定的。通常的情况是因实验客观条件限制，先只能提出一种假说，再经别人一引用就成了真理。所以，大教授都喜欢搞文献综述，经过文字一处理，自己的学术地位就建立起来了。

还有一种假说是，RNAi机制是作为在RNA水平上抵御病毒入侵的防御机制而存在的。在病毒自身基因组所包含，或在病毒复制过程中产生的双链RNA可以被Dicer识别，从而引起病毒RNA降解。已经发现的可以抑制宿主RNA干扰的病毒蛋白如马铃薯X病毒编码的Cmv2b蛋白，兽棚病毒编码的B2蛋白等证明RNAi是一种假说而已，不具备推广性能，不能把从马铃薯的结论直接推广到兽棚病毒。

文献实验的可重复性值得怀疑，比如RNAi机制中的相关因子如内源性双链RNA及蛋白因子可以在多种层次上对基因表达进行调。笔者到目前为止还没有读有任何实证的文献。

因为诺奖效应，RNAi科研成果实际共享一开始就被夸大，如，诺奖吹嘘的RNAi在基因沉默方面具有高效性和简单性，是基因功能研究的重要工具。在理论上，药物属于标靶基因即疾病基因的抑制剂，因此RNAi模拟了药物的作用。RNAi在今天的制药产业中用来确认药物靶标。到目前为止，没有一家大的制药公司公开承认大量使用RNAi技术，RNAi本质上是医生骗无知病人金钱的工具。如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因完全是无稽之谈。在疾病治疗方面，双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗，如肿瘤、老年视黄斑退化、类风湿性关节炎、肥胖症、帕金森病等。一句话，RNAi包治百病，成果被无限夸大。


再看实验仪器问题，有研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导，这是一个博士生的创造。除了美国一个博士论文里的猜测，到目前为止还没有具体的文章发表。至于RNA解旋酶也是参与RNAi机制的因子的结论也属于查无实据，最早由一个学术大牛在文献综述中提出假设，经他的博士生们一引用，一传十，十传百就成了真理。

道理很简单，电子显微镜照片应该一致，同样的样品，相同的分辨率放大倍数，照片形貌可能完全不一样，不管飞利浦电镜，还是日立电镜都应该一样，如果不一样可能就是其中一台电镜的分辨率错了。发表文章应该用最少两台不同厂商的电镜照片才是可信的。科学仪器生产厂商的标准不一，技术水平参差不齐，飞利浦的1000倍放大照片，岛津电镜需要1200倍才能观察到。放大倍数多一倍少一倍对于微观尺度的影响大得不是一般，何况差了一倍多。著名的Robertson模型测鞘磷酯，胆固醇，糖酯构成细胞壁7.5纳米，其实5分钟喷碳的厚度也大于7.5纳米。在岛津电镜下测得7.5个纳米，同一样品在东芝电镜下可能是75纳米甚至750纳米。所以，从研究者用的电子显微镜型号就已证明该研究成果是捕风捉影，牵强附会。

2007年诺贝尔医学奖，基因靶向技术。它的实用性也值得怀疑。对于EGFR基因突变，采样，检测方法与设备是个大问题。检测技术的灵敏度，仪器的工作状况，取样的偏差和肿瘤的异质性等，导致虽然存在基因突变，但是没有检测出来。比如血液样本中，癌细胞裂解释放的DNA浓度低，胸水样本中肿瘤细胞较少等，这些因素都可能导致检测结果阴性。

尽量用分析纯,别图省钱用化学纯,这样可以直接使用化学试剂生产厂商的数据，可以轻松为自己辩护。

使用激光共聚焦荧光显微镜虽然可以让论文增色不少，但荧光显微镜有个缺点，当样本较厚时，会产生很多干扰荧光，影响结果。都得了诺贝尔奖了，不同荧光染料的选用一直是模模糊糊的。细胞核，GFP蛋白质表达用的荧光染料是不一样的。转盘式共聚焦显微镜是唯一可以活体观察的显微镜，加上荧光漂泊恢复技术，FRAP，GFP绿色荧光蛋白，活体实验就是世界一流。流式细胞计flow cytometry是从密立根油滴实验得来的灵感，流式细胞仪的问题是没有考虑细胞壁间摩擦生电问题，密立根为什么用油滴而不是水滴做实验?因为水滴摩擦生电问题不能忽略，流式细胞仪用后要仔细清洗以防堵塞，必须用脂肪类营养液而不是无机盐水营养液。喷嘴一次只能允许一个细胞通过，密立根喷嘴一次只允许一个电子通过。密立根油滴实验早已证明是学术不端，而流式细胞计从来没有引起怀疑，现在都被当成真理在课堂上教授。

文献很多电镜的类型与可靠性查无实证，比如在真核生物当中，还存在另外一种小分子RNA（microRNA）也能引起RNA干扰现象。microRNA大多20-22nt长，前体具有类似发夹性的茎环结构。microRNA产生于该茎环结构的双链区。其特点与siRNA基本上相同。这是化学结构分析得来的结论，还是直接电镜观察的结果，没有文献可以引用。

再看逻辑问题，在秀丽隐杆线虫的RNAi中必须的因子是EGO1也没有发现实质性文献证实，这是一种RdRP（RNA-dependent RNA Polymerase），植物中也存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA（或siRNA）作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在差异，这不是说了等于没说吗？一言以蔽之，基因工程研究的逻辑一直是混乱的。

肿瘤本身很复杂，没有人知道具体原因到底是什么。EGFR基因没有突变，EGFR蛋白数量增多了，也可能导致肿瘤癌变。其他的基因发生突变驱动了肿瘤的增殖，但是被激活的信号通路恰好经过EGFR这个靶点，实验侥幸成功获得诺奖。基于基因靶向理论的基因检测技术一直是有问题的，检测结果不准，检测到基因突变使用靶向药物不一定有效甚至有害。当然也不敢说检测基因数目多就一定能够解决这个问题，因为肿瘤太过于复杂，不光有信号通路交叉的问题，还有遗传修饰的问题，检测的基因数目多只可能避免一些错误。中医通过“望闻问切”也可能诊断出癌症，到了癌症晚期，小孩子也可以看出病人得了癌症。基因编辑的所谓脱靶效应没有解决，EGFR距离实际使用还是天方夜谭。

1991年诺奖细胞中量子通道，是为了抢占科技高地摆的的乌龙。2012诺奖细胞核重新编程，把美洲爪蟾的普通上皮细胞核移植入卵细胞，并发育成成熟的爪蟾，这也是人类第一次从动物的成体细胞中重新复制出一个新的动物。该实验其实是不可重复的，完全不具备推广性与延展性。发现四种特殊的基因，如果一次导入这四种基因，就可以把成熟的纤维细胞“再编程”为不成熟的干细胞，继而发育成为其他的细胞。这就是说成熟的细胞可以在完好无损的前提下，返老还童，该实验结果也是不可重复的。

材料基因研究的最大问题就是一叶障目，不见泰山。生物体的宏观效应肯定会影响微观，宏观如何影响微观目前为止还没有可靠的模型。在没有任何合适的理论，可行性前景的情况下，对细胞，DNA 以及蛋白组织的微观结构各方面过分的研究以及开发。生命有其内在的特殊规律，生命与自然界是平衡发展，相互影响的。搞生命科学的专家为了自己的饭碗是绝对不会说出来的，只能由技术伦理专家来讨论。


结论

现阶段，材料基因以及西医的研究手段本质上与中医类似，用的都是模糊手法，毫无底蕴与科学理论凝练。《细胞生物学》很多理论都是理想状态的描述，用理想状态来实现现实状态本身就是有问题的。

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